分子植物科學卓越創新中心上海植物逆境中心通過 all-in-one策略及TMV Ω翻譯增強子序列實現基因精確敲入

文章來源:分子植物科學卓越創新中心/植物生理生態研究所  |  發布時間:2019-09-30  |  【打印】 【關閉

  

  2019年9月25日,Plant Biotechnology Journal雜志在線發表了來自中國科學院分子植物科學卓越創新中心上海植物逆境生物學研究中心Daisuke Miki研究組和朱健康研究組合作的題為“Gene targeting in Arabidopsis via an all-in-one strategy that uses a translational enhancer to aid Cas9 expression”的研究論文。該研究在原來的基礎上,實現了一步到位(all-in-one)的基因打靶方法。

  在該研究中,將Cas9蛋白、gRNA和HR修復供體序列一次性全部設計在同一個載體上進行一次轉化(如下圖所示)。此外,該研究還增加源于TMV的Ω翻譯增強子序列以增強Cas9蛋白的表達,在HR供體序列兩側增加sgRNA識別位點及使用具有EC1.1啟動子的嵌合EC1.2 / DD45增強子來驅動Cas9表達。

  該研究發現,在不使用增強子等元件的條件下,基因敲入的效率只有0.68%。而通過利用源于TMV的Ω翻譯增強子序列增強Cas9蛋白的表達,在DD45啟動子的驅動下,能將基因敲入的效率提高3倍,達到2.4%。此外,研究發現,EC1.2/DD45的增強子配合EC1.1啟動Cas9蛋白的表達,在該體系中并沒有效果。在HR供體序列兩側增加sgRNA識別位點,也不能增加基因敲入的效率。

  該研究表明,盡管使用all-in-one策略進行基因打靶的效率低于兩步法的效率,但是在未來的工作中,將進一步優化all-in-one策略,提高基因打靶的效率,使其能更高效地應用于擬南芥的任一生態型或者基因組背景植株,或其他能使用浸花法轉化的高等植物。

  本研究得到了中國科學院的資助。彭方楠碩士和張文心碩士為論文的共同第一作者,Daisuke Miki研究員和朱健康研究員為論文的共同通訊作者。

  論文鏈接:https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1111/pbi.13265

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